In-situ-Hybridisierung auf Metaphasechromosomen (lang)

Vorbehandlung der Objektträger

(optional)

2-3 h

Bei 60°C backen 

10 min

5 ml 200 mM HCl 
+ 95 ml aqua dest. -> auf 37°C vorwärmen 
+ 1 ml (=10mg) Pepsinlsg. 

5 min

Objekträger in dieser Lösung bei 37°C inkubieren 

Gesamtzeitbedarf ca. 4 Stunden


Fixierung

(optional)

5 min

Objektträger in PBS bei RT inkubieren 

mit 100 µl Fixierlösung überschichten 

10 min

Objektträger mit Deckglas abdecken und bei RT inkubieren 

5 min

Deckglas entfernen und bei RT in PBS inkubieren 

3x5 min

Ethanolreihe: 70%, 95%, 96% 

15 min

Lufttrocknen 

Fixierlösung:

1/20 vol.

1M MgCl2 

9/20 vol.

1X PBS 

1/2 vol.

2% hochreine Formaldehydlösung, bei 4°C gelagert

Gesamtzeitbedarf ca. 1 Stunde


Denaturierung und Prähybridisierung der Sonde

(für Sonden für hochrepetitive DNA nicht notwendig)

4 µl biotinylierte Sonden-DNA (~20 ng/µl) 
4 µl Cot-1 DNA (1 g/l) (optional)
8 µl 96% Ethanol
(Mengen je Objektträger)

10 min

Trocknen in der SpeedVac 

Aufnehmen in 12 µl Hybridisierungspuffer 

 

3 min

Sonde inkubieren bei 75-80°C (PCR-Maschine) 

5 min

Zentrifugieren und auf Eis oder -20°C packen 

30 min

Pre-annealing bei 37°C 

Hybridisierungspuffer:

2xSSC 

50 % hochreines deionisiertes Formamid

10 % Dextransulfat

(1 % Tween 20)

währenddessen...

Denaturierung der Ziel-DNA

Methode #1:

vorher

Küvette mit 70% Formamid, 2xSSC pH7 auf 75°C vorwärmen 

3 min

Objektträger bei 75°C denaturieren (oder 5 min 72°C)

Denaturierungslösung:

8 ml

20x SSC 

16 ml

aqua dest. 

56 ml

Formamidlösung 

pH 7 

Gesamtzeitbedarf ca. 1 Stunde

Methode #2:

5 min

10µl Sonde auf Objektträger, mit Deckglas abdecken und bei 72°C auf Heizplatte inkubieren


Hybridisierung

10 µl der vorbereiteten Sonde auf Objektträger geben

mit 22x22 mm Deckglas blasenfrei abdecken und Rand mit Fixgum verschließen

Über Nacht in feuchter Kammer bei 37°C inkubieren

Gesamtzeitbedarf ca. 1 bis 3 Tage


Post-Hybridisierungs-Waschen

Deckglas entfernen

3x5 min

in 50% Formamid / 2xSSC bei 42°C/37°C sanft schütteln

3x5 min

in 2xSSC bei 42°C/37°C sanft schütteln

5 min

In SSCT bei RT/37°C inkubieren

Gesamtzeitbedarf ca. 45 min


Detektion

Avidin-FITC und Anti-avidin-AK/Biotin in SSCTM (4xSSC, 0,05% Tween 20, 5% BSA oder Milchpulver) verdünnen entsprechend Herstellerangaben (gewöhnlich 1:100...500).

100 µl SSCTM auf Objektträger, mit 22x50 mm Deckglas abdecken

15 min

bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren

kurz in SSCT waschen

30 min

+10 µl 1:500 Verdünnung avidin-FITC (in SSCTM), 
bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren

3X3 min

waschen in 4xSSCT

30 min

+10 µl 1:100 Verdünnung anti-avidin-Antikörper, 
bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren

3X3 min

waschen in 4xSSCT

30 min

+10 µl 1:500 Verdünnung avidin-FITC, 
bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren

5 min

Waschen in SSCT

2x5 min

In PBS

3x5 min

70%, 95%, 96% Ehanol

10 min

Lufttrocknen

 Gesamtzeitbedarf ca. 3 1/2 Stunden