In-situ-Hybridisierung auf Metaphasechromosomen (lang)

Vorbehandlung der Objektträger

(optional)

2-3 h	Bei 60°C backen
10 min	5 ml 200 mM HCl  + 95 ml aqua dest. -> auf 37°C vorwärmen  + 1 ml (=10mg) Pepsinlsg.
5 min	Objekträger in dieser Lösung bei 37°C inkubieren

Gesamtzeitbedarf ca. 4 Stunden

---

Fixierung

(optional)

5 min	Objektträger in PBS bei RT inkubieren
	mit 100 µl Fixierlösung überschichten
10 min	Objektträger mit Deckglas abdecken und bei RT inkubieren
5 min	Deckglas entfernen und bei RT in PBS inkubieren
3x5 min	Ethanolreihe: 70%, 95%, 96%
15 min	Lufttrocknen

Gesamtzeitbedarf ca. 1 Stunde

---

Denaturierung und Prähybridisierung der Sonde

(für Sonden für hochrepetitive DNA nicht notwendig)

	4 µl biotinylierte Sonden-DNA (~20 ng/µl)  4 µl Cot-1 DNA (1 g/l) (optional) 8 µl 96% Ethanol (Mengen je Objektträger)
10 min	Trocknen in der SpeedVac
	Aufnehmen in 12 µl Hybridisierungspuffer

 

3 min	Sonde inkubieren bei 75-80°C (PCR-Maschine)
5 min	Zentrifugieren und auf Eis oder -20°C packen
30 min	Pre-annealing bei 37°C

währenddessen...

Denaturierung der Ziel-DNA

Methode #1:

vorher	Küvette mit 70% Formamid, 2xSSC pH7 auf 75°C vorwärmen
3 min	Objektträger bei 75°C denaturieren (oder 5 min 72°C)

Gesamtzeitbedarf ca. 1 Stunde

Methode #2:

5 min

10µl Sonde auf Objektträger, mit Deckglas abdecken und bei 72°C auf Heizplatte inkubieren

10 µl der vorbereiteten Sonde auf Objektträger geben

mit 22x22 mm Deckglas blasenfrei abdecken und Rand mit Fixgum verschließen

Über Nacht in feuchter Kammer bei 37°C inkubieren

Gesamtzeitbedarf ca. 1 bis 3 Tage

Post-Hybridisierungs-Waschen

• Alles in abgedunkelten Küvetten durchführen!
• Vorwärmen auf 42°C für Alphasatellitensonde, 37°C für andere Sonden:
  • 300 ml 50% Formamid / 2xSSC pH 7,5-8
  • 300 ml 2 x SSC
  • 300 ml SSCT (4xSSC + 0,03% Tween 20)

	Deckglas entfernen
3x5 min	in 50% Formamid / 2xSSC bei 42°C/37°C sanft schütteln
3x5 min	in 2xSSC bei 42°C/37°C sanft schütteln
5 min	In SSCT bei RT/37°C inkubieren

Gesamtzeitbedarf ca. 45 min

---

Detektion

Avidin-FITC und Anti-avidin-AK/Biotin in SSCTM (4xSSC, 0,05% Tween 20, 5% BSA oder Milchpulver) verdünnen entsprechend Herstellerangaben (gewöhnlich 1:100...500).

	100 µl SSCTM auf Objektträger, mit 22x50 mm Deckglas abdecken
15 min	bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren
	kurz in SSCT waschen
30 min	+10 µl 1:500 Verdünnung avidin-FITC (in SSCTM),  bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren
3X3 min	waschen in 4xSSCT
30 min	+10 µl 1:100 Verdünnung anti-avidin-Antikörper,  bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren
3X3 min	waschen in 4xSSCT
30 min	+10 µl 1:500 Verdünnung avidin-FITC,  bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren
5 min	Waschen in SSCT
2x5 min	In PBS
3x5 min	70%, 95%, 96% Ehanol
10 min	Lufttrocknen

• Einbetten in Citifluor mit 0,2 µg/ml DAPI
• Lagern bei Dunkelheit und -20°C, ggf. Ränder mit Nagellack versiegeln

 Gesamtzeitbedarf ca. 3 1/2 Stunden